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蛋白質(zhì)的測定方法,目前仍以1883年凱達爾氏(Kiedahl)發(fā)明的定氮法為基礎,它根據(jù)各種蛋白質(zhì)都具有固定比數(shù)的氮這一事實,通過對氮的測定而推算出蛋白質(zhì)含量,此法所得的含氮量除了確定屬于蛋白質(zhì)組成成分的氮以外,還包括非蛋白質(zhì)組成的其他有機及無機態(tài)氮,所以換算所得的蛋白質(zhì)含量稱作為粗蛋白含量,一般蛋白質(zhì)中的含量為18%,換算后即每6.25克蛋白質(zhì)中含有1克氮,因此6.25成為換算系數(shù)K,但是不同的農(nóng)產(chǎn)品及其制品的實際含氮量有區(qū)別,所以不同農(nóng)產(chǎn)品必須采用不同的換算系數(shù),如花生、大豆、蠶豆、大麥、小麥、燕麥、黑麥等含氮為17.6%,求得K=5.7,蕎麥、葵花籽、亞麻籽、大麻籽、棉花籽、蓖麻籽等換算系數(shù)則為K=5.50,玉米、菜籽為6.00,水稻為5.95,上述以外的其他農(nóng)產(chǎn)品的換算系數(shù)均適用6.25。盡管如此,目前世界上還沒有直接分離測定含蛋白質(zhì)的可行方法。因此,迄今為止在國內(nèi)外凱氏定氮法仍然是測定蛋白質(zhì)含量的經(jīng)典方法。所得結果準確、穩(wěn)定。
我公司研制生產(chǎn)的KDN系列定氮儀(蛋白質(zhì)測定儀),是引進消化吸收國內(nèi)外檢測新技術,結合我國國情,應用凱氏定氮法原理,采用化學與物理學相結合完成的成套蛋白質(zhì)含量快速測定裝置。為糧食、食品、飼料、農(nóng)業(yè)、商檢等檢測部門提供了理想的檢測設備。
KDN-04A(08A)型定氮儀檢測原理為:
整套裝置,由電加熱消化器、蒸餾器兩部分組成。要提高蛋白質(zhì)含量測定的檢測速度,其關鍵是要加速樣品消化煮解的時間,KDN系列定氮儀消化裝置采用井式電加熱爐,增大了消化管受熱面,使消化管連同管內(nèi)所注入的10ml H2SO4及試樣置入消化管插入井式爐內(nèi)加熱取得更佳的熱效應,在消化前置入硒片作為催化劑進一步加速消化煮解,大大縮短消化時間。消化管內(nèi)溢出的SO2等有害氣體,通過消化管上的排污管經(jīng)抽吸泵由水帶入下水道,有效的抑制有害氣體的外逸,由省略了實驗室中安裝毒氣通風櫥,試樣經(jīng)40分鐘左右消化煮解,即可*消化。
消化的過程主要反應如下:
R·C·H·NH2·COOH + H2SO4 → CO2 + SO2 + NH3 + H2O
2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4
蒸餾與吸收過程的主要反應如下:
(NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O
NH3 + 4H3BO3 → NH4HB3O7 + 5H2O
然后經(jīng)滴定,計算蛋白質(zhì)含量,滴定的過程是鹽酸和硼酸氫銨反映的過程。
NH4HB3O7 + HCl + 5H2O → NH4Cl + 4 H3BO3
1.1分析天平:感量0.0001g
1.2實驗室用粉碎機或研缽
1.3酸式滴定管:25ml或10ml
1.4錐形瓶:容積250ml
1.5分樣篩:孔徑0.45mm(40目)
2.試劑
2.1鹽酸(HCl):分析純(GB622) 0.05mol/L標準液,(4.2ml鹽酸,注入1000ml蒸餾水)碳酸鈉法標定鹽酸。
2.2氫氧化鈉(NaOH):化學純或工業(yè)純(GB629)、40g溶于蒸餾水中溶成100ml,配成40%水溶液(m/v)。
2.3硼酸(H3BO3):分析純(GB628)2g,溶于蒸餾水中配成100ml2%水溶液(m/v).
2.4混合指示劑:甲基紅(G5H15N3O2)(HG3-958)溶于乙醇配成0.1%乙醇溶液,溴甲酚綠(HG3-1220)溶于乙醇配成0.5%乙醇溶液,二種溶液等體積混合,陰涼處保存(保存期三個月以內(nèi))。
2.5硫酸銅(CuSO4·5H2O)分析純(GB655)10g;硫酸鉀(K2SO4) (HG3-920)分析純150g,在研缽中研磨,仔細混勻后過40目篩(加速劑)。
2.6濃硫酸(H2SO4)化學純(GB625)(含量98%、無氮)。
3.操作方法
3.1樣品消化
稱取經(jīng)粉碎通過40-60目/寸試樣0.5-1g(視含量而定)無損的置入已洗滌烘干的試管中加催化劑約5g和濃硫酸約10ml。
將消化管分別放入消化架各個孔內(nèi),然后置于消化爐上,開啟抽氣三通連接的水,使抽氣三通處于吸氣狀態(tài)。接通電源,在加熱初始階段需注意觀測,防止試樣因急沸而飛濺。(為防止飛濺,在初化時將電壓調(diào)至150V左右,加熱15分鐘后再滿電壓工作。)
消化結束后(消化液呈澄清透明狀),將消化管架移至冷卻架冷卻至40-50度左右。然后進行下一步的蒸餾。
3.2蒸餾
KDN-04A(08A)型蒸餾器,堿液(NaOH)及蒸餾水(H2O)采用內(nèi)置的電磁泵加入,NaOH、H2O注入接口用橡膠管套入后分別置入裝有NaOH、H2O的容器(自備)內(nèi),加液時按面板上相應開關,液體由電磁泵自動吸入消化管內(nèi),加入毫升數(shù)視標尺所注位置而定(一般堿液加入量是硫酸用量的5倍,加蒸餾水量約15毫升)。
1.打開蒸餾器電源,打開自來水,接冷卻水自來水不必開得過大,出水口有水流出即可,用排水管上的夾子夾緊排水管。
2.打開蒸餾器操作面板右邊的蒸汽開關(蒸汽開關手柄上推為打開蒸汽),同時打開左邊進水開關(進水開關手柄上推為打開進水),待電流表指針指在2A-3A時馬上關閉進水開關(進水開關手柄下推為關閉進水),待蒸汽管噴出氣后再打開進水開關,1分鐘左右后電流表穩(wěn)定在3.5-6A后,關閉蒸汽開關。
3.在250ml三角接收瓶中加入50ml 2%H3BO3和2-3滴混合指示劑,并使接收瓶托盤往上移動,使滴管浸入液面下。
4.向上扳動蒸餾器側面紅色手柄把消化管固定在左邊的托架上,然后按面板上H2O、NaOH開關,分別向消化管內(nèi)注入蒸餾水和氫氧化鈉溶液,然后打開蒸汽開關,向試管內(nèi)注入蒸汽,進行蒸餾,在接收瓶內(nèi)接收液達150ml左右時移下接收瓶,用蒸餾水沖洗滴管口繼續(xù)蒸餾半分鐘,然后關閉蒸汽開關,取下接收瓶,待滴定用。
5.更換消化管,進行下一個樣品的蒸餾。(執(zhí)行第3和第4步)
3.3滴定
用標定后的鹽酸溶液進行滴定接收瓶內(nèi)的溶液,滴定溶液由綠色變?yōu)榈仙珵榻K點,記下消耗鹽酸溶液的毫升數(shù),按下式計算蛋白含量:
蛋白含量(%)=
式中:V2—滴定試樣時消耗酸標準溶液的體積 (ml)
V1—滴定空白時消耗酸標準溶液的體積 (ml)
C—標準酸溶液的摩爾濃度
0.014—氮的毫克當量數(shù)
K—氮換算成粗蛋白質(zhì)的系數(shù)
W—試樣重量 (g)
(空白測定:用0.1克糖代替樣品或不加樣品做空白測定)
平行測定的結果用算術平均值表示,保留小數(shù)后二位。
3.4 換算系數(shù)
結果報告中必須注明氮換算成粗蛋白質(zhì)的系數(shù),換算系數(shù)見下表。
樣品名稱 | 換算系數(shù) | 數(shù)據(jù)來源 |
小麥 | 5.70 | GB2905 |
大麥 | 5.70 | GB2905 |
釀酒大麥 | 6.25 | TOCT10846 |
面粉 | 5.70 | GB5009.5 |
面包 | 5.70 | AOAC14.103 |
大豆 | 6.25 | GB2905 |
| 5.71 | GB5009.5 |
玉米 | 6.25 | 食品常用數(shù)據(jù)手冊 |
| 6.24 | GB5009.5 |
飼料 | 6.25 | GB6432 |
肉制品 | 6.25 | GB5009.5 |
乳制品 | 6.38 | GB5009.5 |
牛奶 | 6.38 | ACAC16.036 |
芝麻 | 5.30 | GB5009.5 |
油菜 | 5.53 | 油菜籽綜合利用 |
3.5注意事項
1.消化時若有氣體外溢,加大抽氣三通連接的自來頭的壓力。消化密封圈每次試驗結束后清洗一遍延長使用壽命。
2.每天工作完,把NaOH溶液外接的皮管移入蒸餾水瓶內(nèi),前面套好消化管抽洗幾次,防止堿液殘留在堿泵內(nèi)而影響使用壽命,也可防止單向閥粘連,待下次使用時,在蒸餾樣品前需先排出100mlNaOH,以防稀釋NaOH,造成個樣品加入的堿液濃度不夠。
3.過一段時間用稀酸清洗一下蒸發(fā)爐,并用清水再沖洗幾次,保養(yǎng)電極。
4.如果操作不當,1保險絲燒斷后,請拔掉電源插頭,重新?lián)Q上新的后,關掉水,打開排水夾子排盡蒸發(fā)爐內(nèi)的水,按照開機步驟重新開機操作。
5.用戶在遵守本儀器的運輸、貯存、安裝、調(diào)整和使用規(guī)程的條件下,如發(fā)現(xiàn)儀器因制造質(zhì)量問題而不能正常工作時,從收獲之日起一年內(nèi)實行三包;或開箱時發(fā)現(xiàn)包裝不良而發(fā)生損壞,附件與裝箱單不符,短缺零件等情況,請與我公司質(zhì)檢部門。來函注明產(chǎn)品型號、編號和出廠日期。本儀器使用時,要求用戶嚴格按照說明誰規(guī)定進行,如有疑問或對結構改進的意見,請來電或來函告知我公司質(zhì)檢部門。
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